1-4 اساس ساختاري و شيميايي اتصال آنتي بادي به آنتي‌ژن
شناسايي آنتي‌ژن بوسيلة آنتي‌بادي بصورت اتصال غير كووالان و برگشت پذير است. انواع واكنش‌هاي غير كووالان از جمله نيروي الكتروستاتيك، پيوندهاي هيدروژني، نيروي واندروالس و پيوندهاي هيدروفوبيك در اتصال آنتي‌ژن به آنتي‌بادي شركت مي‌كنند. اهميت نسبي هر يك از اين پيوندها بسته به ساختمان جايگاه اتصال آنتي‌ژن هر مولكول آنتي‌بادي و ساختمان شاخص‌هاي آنتي‌ژنتيك تغيير مي‌كند. نيروي اتصالي بين يك جايگاه اتصالي آنتي‌بادي و يك اپي‌توپ آنتي‌ژن را ميل پيوندي [1] آنتي‌بادي گويند كه با روش دياليز تعادلي قابل اندازه‌گيري مي‌باشد.
معمولا ميل پيوندي را با ثابت تفكيك [2] (kd) نشان مي‌دهند كه بيانگر غلظتي از آنتي‌ژن موردنياز جهت اشغال نيمي از جايگاههاي اتصالي آنتي‌بادي در محلولي از مولكولهاي آنتي‌بادي است. يك kd كوچكتر، نشاندهنده واكنش قويتر يا ميل پيوندي بالاتر است چون غلظت كمتري از آنتي‌ژن، جهت اشغال جايگاهها موردنياز مي‌باشد. درمورد آنتي بادي هاي اختصاصي عليه آنتي ژن هاي طبيعي معمولا Kd ، بين 10-7 تا 10-11 مولار تغيير مي‌كند. مولكول آنتي‌بادي بدليل داشتن لولا، داراي قابليت انعطاف پذيري است، از اين‌رو يك آنتي‌بادي مي‌تواند با بيش از يك جايگاه اتصالي به يك آنتي‌ژن چند ظرفيتي متصل شود.
در IgE يا IgM پنتامر، هر آنتي‌بادي به‌تنهايي مي‌تواند با تعداد قابل توجهي جايگاه مختلف اتصال برقرار كند (از نظر تئوري با حداكثر 10 جايگاه مختلف). آنتي‌ژن‌هاي پلي‌والان بيش از يك كپي از يك شاخص را دارند. عليرغم اينكه ميل پيوندي هرجايگاه اتصال به آنتي‌ژن براي هريك از اپي‌توپ‌هاي آنتي‌ژن‌هاي پلي‌والان يكسان مي‌باشد ولي نيروي اتصال آنتي بادی به آنتي ژن با در نظر گرفتن اتصال تمام جايگاهها به تمام اپی توپهای در دسترس محاسبه ميگردد. اين نيروی کلي اتصال را ميل پيوندي تام [3] گويند و بسيار قويتر ازميل پيوندي هريك از جايگاهها به تنهايي مي‌باشد. از ديدگاه رياضي، نيروي ميل‌پيوندي تام به ازاي هر جايگاه اشغال شده، بصورت تصاعد هندسي (به‌جاي تصاعد حسابي) افزايش مي‌يابد. بنابراين، يك مولكول IgM با ميل پيوندي پائين مي‌تواند بطور بسيار محكمي به يك آنتي‌ژن چند ظرفيتي متصل شود، چون تعداد زيادي از واكنش‌هاي باميل پيوندي پائين مي‌توانند يك واكنش با ميل پيوندي تام قوي بوجود آورند.
1-4-1 عواملي كه در واكنش اتصال آنتي‌بادي به آنتي‌ژن دخالت دارند:
1-4-1-1 pH محيط
مناسب ترين pH براي واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي بادي pH = 7.2 مي‌باشد. در pH پائين تر از a7.2 اتصال آنتي بادي به آنتي ژن ضعيف مي باشد، بطوريكه در pH = 2.2 كمپلكس آنتي‌ژن و آنتي‌بادي كاملا از يكديگر جدا مي‌شوند. از طرف ديگر اتصال آنتي ژن به آنتي بادي در pH بالا تا حدود a8.6 نيز امكان پذير است. لازم به تذكر است كه IgD نسبت به اسيدها بسيار حساس است و در محيط اسيدي دناتوره مي‌شود.
1-4-1-2 قدرت يوني محيط (μ)
واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي در محيطي كه فاقد الكتروليت‌ها باشد مانند آب مقطر صورت نمي‌گيرد. قدرت يوني محيط در حقيقت مولاريته نمكهاي محلولي است كه آنتي‌ژن و آنتي‌بادي در آن محلول قرار دارند. چنانكه غلظت نمك زياد باشد باعث رسوب آنتي‌بادي و آنتي‌ژن پروتئيني مي‌شود. معمولا سرم فيزيولوژي a0.15 مولار و يا تامپون فسفات نمكي [4] PBS با قدرت يوني a0.02 مولار فسفات در pH=7.2 براي رقيق كردن سرم بيمار و مشاهده واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي بسيار مناسب است.
1-4-1-3 نسبت غلظت آنتي‌ژن و آنتي‌بادي:
واكنش‌هاي چند ظرفيتي بين آنتي‌ژن و آنتي‌بادي، از نظر بيولوژيك حائز اهميت هستند، زيرا بسياري از اعمال اجرايي آنتي‌باديها زماني به اندازه مطلوب تحريك مي‌شوند كه دو يا چند مولكول آنتي‌بادي در كنار هم قرار گيرند و به يك آنتي‌ژن چندظرفيتي متصل شوند. اگر يك آنتي‌ژن چندظرفيتي با آنتي‌بادي اختصاصي خود در يك لولة آزمايش مخلوط شود، اين دو به يكديگر اتصال پيدا كرده و كمپلكس‌هاي ايمني را بوجود مي‌آورند. در غلظت‌هاي مناسب كه منطقه تعادل [5] ناميده مي‌شود آنتي‌بادي و آنتي‌ژن شبكه‌اي با اتصالات متقاطع وسيع تشكيل مي‌دهند كه در آن مولكولها با پيوندهاي غير كووالان به همديگر متصل مي‌شوند، به‌گونه‌اي كه تمام و يا اكثر مولكولهاي آنتي‌ژن و آنتي‌بادي بصورت توده‌هاي بزرگي از كمپلكس‌ها در مي‌آيند. تجزيه كمپلكس‌هاي ايمني به توده‌هاي كوچكتر هم از طريق افزايش غلظت آنتي‌ژن صورت مي‌گيرد كه در آن مولكولهاي آنتي‌ژن آزاد، جاي آنتي‌ژن اتصال يافته به جايگاههاي اتصالي آنتي‌ژن را مي‌گيرند (ناحية فزوني آنتي‌ژن) [6] و هم از طريق افزايش غلظت آنتي‌بادي صورت مي‌گيرد كه در آن مولكولهاي آنتي‌بادي آزاد به‌جاي آنتيباديهاي اتصال يافته به شاخص‌هاي آنتي‌ژني قرار مي‌گيرند (ناحية فزوني آنتي‌بادي)[7].1-4-1-4 تأثير مواد احيا كننده:
ايمونوگلوبولين هاي IgE، IgD و IgM نسبت به مواد احيا كننده مانند 2- مركاپتواتانل و دي‌تيوتريتول (DTT) حساسيت بيشتري نسبت يه IgG و IgA دارند.
بنابراين در بعضي آزمايشهاي آنتي‌ژن – آنتي بادي چنانچه تشخيص و اندازه گيري IgG از IgM موردنظر باشد، با افزودن مقدار معيني از يك ماده احيا كننده به سرم، IgM تجزيه شده، ولي IgG سالم مانده و اندازه‌گيري مي‌شود. البته مشخص است كه در غلظت‌هاي بالاي مواد احيا كننده، تمام كلاسهاي ايمونوگلوبولين تجزيه مي‌شوند.
1-4-1-5 درجه حرارت:
بنظر مي رسد كه درجه حرارت تأثير چنداني بر روي عكس العمل هاي آنتي ژن و آنتي بادي ندارد ولي با اين وجود در درجه حرارت 37°c ، واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي سريعتر قابل رؤيت هستند. در درجات حرارت پائين حتي در صفر درجه سانتيگراد نيز واكنش بين آنتي‌ژن و آنتي‌بادي صورت مي‌گيرد. در حرارت بالاتر از 56°c بمدت نيم ساعت ابتدا IgD, IgE (همچنين سيستم كمپلمان) فعاليت بيولوژيكي خود را از دست مي‌دهند. در درجه حرارتهاي بالاتر از 70°c، ساير كلاسهاي ايمونوگلوبولين نيز ممكن است دناتوره شوند و به آنتي‌ژن متصل نشوند. در بعضي بيماريها، ايمونوگلوبولين خاص در سرم پيدا مي شود كه در درجه حرارت كمتر از 37°c رسوب مي‌كند. به اين دسته از Igها اصطلاحا كرايوايمونوگلوبولين [8] مي گويند و از كلاس IgM و گاهي IgG و بندرت IgA مي‌باشند. از طرف ديگر بعضي از ايمونوگلوبولين ها در گرماي حدود 60 تا 70 درجه سانتيگراد، نامحلول و بطور برگشت‌پذير رسوب مي‌كنند. اين دسته از پروتئين‌ها را پيروگلوبولين [9] مي‌گويند.
1-4-1-6 زمان:[10]
اتصال مولكولهاي آنتي‌بادي به آنتي‌ژن معمولا بسرعت و در عرض چند ثانيه صورت مي‌گيرد ولي براي تشكيل كمپلكس و ديدن واكنش مدت‌زماني وقت لازم است و اين زمان براي هر آزمايش باتوجه به نوع آنتي‌ژن و كلاس آنتي‌بادي متفاوت است. بطور كلي چنانكه آنتي بادي از كلاس IgM و مولكولهاي آنتي ژن درشت باشند، زمان لازم براي ديده شدن كمپلكس آنتي ژن و آنتي بادي كوتاهتر از كلاس IgG است، مانند تعيين گروه خوني ABO در مقايسه با سيستم Rh.
1-4-1-7 عوامل مداخله‌گر موجود در سرم:[11]
گاهي موادي كه بصورت طبيعي در سرم حضور دارند مانع بعضي از واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي مي‌شوند. بعضي از مواد شناخته شده عبارتند از: اينترفرون، كمپلمان، بتاليزين‌ها و يا موادي كه توسط ميكروبهاي فلور طبيعي بدن ترشح و وارد خون مي‌شوند.
1-5 انواع واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي
بوسيلة آزمايشهاي سرولوژيك مي‌توان يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي مجهول را شناسايي و مقدار آن را اندازه‌گيري نمود. وقتي كه آنتي‌ژن و آنتي‌بادي ضدآن با يكديگر مخلوط مي‌شوند، براساس فرم يا ساختمان مولكولهاي آنتي‌ژن، كمپلكس آنتي‌بادي و آنتي‌ژن به شكلهاي مختلفي تشكيل مي‌شود و رسوب مي‌كنند. بنابراين براساس شكل مولكولهاي آنتي‌ژن، واكنش‌هاي آنتي‌ژن – آنتي‌بادي را به سه دسته تقسيم مي‌نمايند.
1-5-1 واكنش‌هاي رسوبي [12]
در اين واكنش‌ها آنتي‌ژن بصورت مولكولهاي محلول است مانند پروتئين‌هاي سرم يا مواد ترشح شده از ميكروب‌ها
1-5-2 واكنش‌هاي آگلوتيناسيون [13]
اگر آنتي‌ژن بصورت ذرات غيرمحلول مانند باكتريها باشد، واكنش را آگلوتيناسيون مي‌نامند (اگر آنتي‌ژن گلبول قرمز باشد، واكنش را هماگلوتيناسيون مي‌گويند)
1-5-3 واكنش‌هاي فلوكولاسيون [14]
وقتي كه آنتي‌ژن بصورت ذرات كلوئيدي باشد مانند كارديوليپين قلب گاو، واكنش را فلوكولاسيون مي‌نامند.
1-6 آنتي‌بادي مونوكلونال [15]
در سال 1984، كهلروميلشتاين[16] همراه با يرن [17] بخاطر فراهم آوردن و تهيه آنتي‌بادي مونوكلونال، جايزة نوبل را دريافت نمودند. امروزه مي‌دانيم كه آنتي‌سرم از كلون‌هاي سلولهاي مختلفي بوجود مي‌آيد و درنتيجه كلاس، زير كلاس يا ايزوتايپ آنتيباديهاي توليد شده، ويژگيها، تيتر و ميل تركيبي آنها متفاوت مي‌باشد. در يك آنتي‌سرم ممكن است آنتيباديهاي مختلفي عليه آنتي‌ژن‌هاي متفاوت كه داراي خصوصيات متفاوتي هستند وجود داشته باشند.
بنابراين آنتي‌سرم، بخاطر پلي‌كلونال بودن، براي تعيين ساختمان دقيق و تفاوت آنتي‌ژنيك بين مولكولها در سطح هر اپي‌تپ مناسب نمي‌باشد. همچنين مصرف درماني آن نيز بسيار محدود مي‌باشد. برعكس، مونوكلونال آنتي‌بادي با افينتي يا ميل تركيبي زياد عليه يك شاخص آنتي‌ژنيك ايجاد مي‌شود و فقط مختص آن ناحيه مي‌باشد.
مونوكلونال آنتي‌بادي كه از يك كلون بدست بيايد همگي خصوصيات كاملا يكساني داشته و مي‌توان آنها را به مقدار زياد تهيه نمود. اين آنتي‌باديها در درمان و تحقيقات به مقدار بسيار زيادي مصرف دارند.
مقايسة آنتي‌سرم پلي‌كلونال و آنتي‌بادي مونوكلونال
|
خصوصيات
|
آنتي‌سرم پلي‌كلونال
|
آنتي‌بادي مونوكلونال
|
|
محل‌هاي آنتي‌ژنيك
|
زياد
|
يك عدد
|
|
اختصاصي بودن
|
به چند آنتي‌ژن مختلف متصل مي‌شوند
|
فقط به يك آنتي‌ژن خاص متصل مي‌شود
|
|
افينيتي يا ميل تركيبي
|
متغير
|
زياد
|
|
آلودگي به ساير ايمونوگلوبولين‌ها
|
زياد
|
بسيار كم
|
|
مقدار حاصله
|
زياد
|
بسيار كم
|
|
مخارج تهيه
|
كم
|
زياد
|
|
مصرف
|
متوسط
|
بسيار زياد
|
سلولهاي معمولي را نمي‌توان در خارج از محيط زنده بمدت طولاني نگهداري نمود. براي رفع اين اشكال، در مطالعات ژنتيك سلولي، از چندين سال پيش از سلولهاي پيوندي كه از تركيب دو نوع سلول غيرمشابه تشكيل مي‌شود استفاده مي‌نمودند. براي تهيه منوكلونال آنتي‌بادي، سلولهاي توليد كننده آنتي‌بادي را با سلولهاي انتخابي فناناپذيري كه دائما رشد مي‌كنند (توموري) به كمك مواد خاص ادغام و پيوند مي‌زنند. تحت اين شرايط، سلولها بطور تصادفي باهم ادغام شده كه مخلوطي از سلولهاي پيوندي و غيرپيوندي حاصل ميگردد. سلولهاي مايلوما سلولهاي فناناپذيري هستند كه براي تهيه منوكلونال آنتي‌بادي بكار مي‌روند. اين سلولها در حقيقت يك تومور مونوكلونال پلاسما سل‌هاي ترشح كنندة آنتي‌بادي مي‌باشند. در سال 1975، كهلروميلشتاين گزارش دادند كه سلولي پيوندي بوجود آورده‌اند كه در محيط كشت بطور مداوم رشد مي‌نمايد و آنتي‌بادي با خصوصيات واحدي توليد مي‌نمايند. در سال 1976 اين دانشمندان نشان دادند كه با پيوند اين دو نوع سلول مي‌توان سلول پيوندي جديدي ايجاد نمود كه خصوصيات هر دو سلول والد را دارا باشند.
بعنوان مثال، اين سلول هيبريد، فناناپذيري را از سلول توموري مايلوما و ترشح آنتي بادي اختصاصي را از سلولهاي B طحال به ارث مي‌برد. به اين نوع سلولهاي پيوندي هيبريدوما مي‌گويند. براي جدا كردن سلولهاي هيبريدوما، از محيط كشت انتخابي استفاده مي‌شود بطوريكه فقط سلولهاي هيبريد مي‌توانند در اين محيط رشد نمايند، ولي سلولهاي مايلوما بصورت آزاد و يا باهم ادغام شده و همچنين سلولهاي طحال آزاد و يا بهم پيوند شده قادر به رشد در اين محيط انتخابي نبوده و بزودي از بين مي‌روند. در اين مرحله، سلولهاي پيوندي زنده مخلوطي از سلولهايي هستند كه همگي قادر به توليد آنتي‌بادي نمي‌باشند. بعلاوه، از سلولهايي كه قادر به سنتز آنتي‌بادي هستند فقط تعداد كمي قادر به توليد آنتي‌بادي اختصاصي عليه آنتي‌ژن خاص مي‌باشند. درنتيجه، بايد ابتدا با آزمايش خاص از كشت سلولي، سلولها را در ديشهاي كشت 96 خانه‌اي تقسيم نموده و تحت اثر محيط كشت اختصاصي قرار مي‌دهند بطوريكه فقط سلولهاي هيبريدوما رشد نمايند. سپس سوپرناتانت اين سلولها را براي حضور آنتي‌بادي اختصاصي آزمايش مي‌نمايند. بايد توجه داشت كه كشت‌هاي مثبت ممكن است شامل سلولهايي باشند كه هم آنتي‌بادي اختصاصي و هم غير اختصاصي ترشح مي‌كنند. براي جداكردن اين سلولها از يكديگر، بايد از كشت خيلي رقيق سلولي استفاده نمود. بطوريكه در هر خانه ديش بطور تقريبي، فقط يك سلول رشد نمايد. درنتيجه در هر خانه ديش همه سلولهاي خاصله از يك سلول پايه مشتق شده‌اند كه همگي مونوكلونال بوده و يك نوع مولكول آنتي‌بادي ترشح مي‌نمايند. اين مولكول مونوكلونال فقط به يك محل آنتي‌ژنيك در مولكول آنتي ژن متصل مي‌شوند و مي‌توان آنها را براي مصارف گوناگون تحقيقي، تشخيصي و درماني بكار برد.
تشخيص باليني آنتي‌ژن‌هاي محلول بصورت بسيار دقيق، تشخيص باكتريها، ويروس‌ها و پارازيت‌هاي بيماريزا به‌نحو اختصاصي تشخيص آنتي‌ژن‌هاي سطح سلولهاي متفاوت، تهيه مجموعة تستي براي مصارف آزمايشگاهي، كاربرد در تصويربرداري اختصاصي، درمان عفونت‌هاي ميكروبي، ويروس و انگلي، درمان تومورها و استفاده در تهيه واكسن‌ها از جمله مصارف آنتيباديهاي مونوكلونال مي‌باشد.
نظرات شما عزیزان:
تبادل
لینک هوشمند